酶聯(lián)免疫知多少？

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），是酶免疫測定技術(shù)中應用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。

基本原理

ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結合，此種結合不會(huì )改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過(guò)底物的顏色反應來(lái)判定有無(wú)相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過(guò)ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

酶的特性

用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產(chǎn)物易于顯現；能商品化生產(chǎn)。如今應用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。

1、辣根過(guò)氧化物酶

過(guò)氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱(chēng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應時(shí)的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀(guān)察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時(shí)內不改變,是目前國內ELISA中最常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩定；⑶5－氨基水楊酸(5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。

2、堿性磷酸酶

系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類(lèi)很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。

ELISA方法的基本類(lèi)型

根據ELISA所用的固相載體而區分為三大類(lèi)型：

一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類(lèi)是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱(chēng)為斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）；再一類(lèi)是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱(chēng)為布ELISA（C－ELISA）。

在微量板ELISA中，又根據其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

注意事項

1、操作前應對實(shí)驗的物理參數有充分的了解，如環(huán)境溫度(保持在18 C～25℃)、反應孵育溫度和孵育時(shí)間、洗滌的次數等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。

2、正確使用加樣器加樣器應垂直加入標本或試劑，避免刮擦包被板底部。加樣過(guò)程中避免液體外濺，血清殘留在反應孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，避免污染，加樣次序要與說(shuō)明書(shū)一致，否則可導致結果錯誤，實(shí)驗重復性差。

3、手工洗板加洗液時(shí)沖擊力不要太大，洗滌次數不要超過(guò)說(shuō)明書(shū)推薦的洗滌次數，洗液在反應孔內滯留的時(shí)間不宜太長(cháng)。不要使洗液在孔間竄流，造成孔問(wèn)污染，導致假陰性或假陽(yáng)性。

4、要保證加液量一致我們在使用時(shí)感覺(jué)滴瓶加液不如加樣器好，滴瓶不易控制加液量不準，造成顯色不統一，判斷錯誤。

5、顯色液量不可過(guò)多加樣的工作環(huán)境不能處于陽(yáng)光直射的環(huán)境下，加顯色系統后要避光反應，顯色液量不能過(guò)多，以免顯色過(guò)強。

6、試劑的影響因數：應選用有國家批準文號，質(zhì)量靠得住的產(chǎn)品，不能圖便宜，忽視質(zhì)量保證。試劑應妥善保存于4℃冰箱內，在使用時(shí)先平衡至室溫，不同批號的試劑組分不宜交叉使用。試劑開(kāi)啟后要在一周內用完，剩余的試劑下次用時(shí)應先檢查是否變質(zhì)，，顯色劑如被污染變色將造成全部顯色，導致錯誤結果。過(guò)期的試劑不宜再用，若別無(wú)選擇，應做好雙份質(zhì)控品的監測，確保結果的可靠性。